Modified amino acids as useful tool for peptide synthesis and their measurement in complex matrices

Abstract

Negli ultimi anni sono stati scoperti e caratterizzati numerosi peptidi biologicamente attivi che, mediante interazioni con opportuni recettori, influenzano le cellule in una serie di funzioni vitali quali il metabolismo, le difese immunitarie, la proliferazione cellulare. Questi peptidi, tuttavia, nella loro forma nativa non possono essere utilizzati come farmaci, data la loro scarsa stabilità metabolica e il difficile assorbimento dopo somministrazione orale; bisogna perciò disporre di pepdidomimetici, che siano in grado di mimare gli effetti farmacologici dei peptidi naturali, ma che presentino allo stesso tempo una maggiore stabilità e biodisponibilità. Nella realizzazione della sintesi peptidica riveste un ruolo importante la scelta di gruppi protettori utili a mascherare la funzione amminica e carbossilica di amminoacidi e peptidi. La necessità di una sequenziale protezione e deprotezione delle varie funzionalità presenti fa si che, sia l’introduzione, che la rimozione di un gruppo protettore richiedano un’accurata progettazione sintetica, al fine di garantire il grado richiesto di ortogonalità tra i vari gruppi protettori utilizzati. Nella maggior parte dei casi per proteggere la funzione carbossilica di α-amminoacidi si utilizzano gruppi protettori semipermanenti che rimangono inalterati durante la costruzione della catena peptidica e vengono rimossi alla fine della sintesi. La formazione di esteri è stata allo scopo ampiamente utilizzata. In particolare il gruppo carbossilico viene convertito in estere metilico, benzilico, tert-butilico e benzidrilico. Tuttavia, il ripristino della funzione carbossilica al termine della sintesi peptidica presenta delle difficoltà. Infatti, in questi casi la deprotezione della funzione carbossilica prevede l’idrolisi basica degli stessi esteri in presenza di solventi organici. Questa procedura, anche quando è eseguita in condizioni strettamente controllate, può causare epimerizzazione del peptide e altre reazioni collaterali. Allo scopo è stata realizzata la deprotezione della funzione carbossilica di esteri metilici di alfa-amminoacidi utilizzando ilidi allo zolfo in particolare la dimetilsulfossonio metilide. In un tipico esperimento l'estere metilico della N-nosil-L-alanina è stato trattato con la metilide di dimetilsolfossonio in THF nel rapporto molare 1:2 per trenta minuti. A seguito di idrolisi acida si recupera con resa quantitativa il corrispondente amminoacido deprotetto sulla funzione carbossilica. La reazione è stata applicata ad una serie di esteri metilici di alfa-amminoacidi protetti sulla funzione amminica con il gruppo terbutossicarbonile (Boc), nosile (Ns)e benzilossicarbonile (Cbz) e di esteri metilici di acidi carbossilici. In tutti gli esperimenti eseguiti il corrispondente acido carbossilico è stato recuperato con rese elevate e in forma pura. La deprotezione della funzione carbossilica è stata realizzata con successo anche con substrati amminoacidici protetti in catena laterale con gruppi protettori acido-labili. Inoltre, eseguendo la procedura su substrati enantiopuri, è stato dimostrato che la reazione avviene senza racemizzazione. Questa metodologia è generale e può essere considerata una valida alternativa all'idrolisi degli esteri quando un substrato è sensibile alle condizioni di idrolisi. La dimetilsulfossonio metilide è stata usata, anche, come unico ed utile reagente per la deprotezione simultanea della funzione carbossilica protetta come estere e della funzione amminica protetta con il 9-fluorenilmetossicarbonile (Fmoc) di α-amino acidi e oligopeptidi. La nuova metodologia è stata applicata con successo nella sintesi peptidica, basata sulla “Fmoc-chemistry”, sia in fase solida che in soluzione. I corrispondenti amminoacidi e peptidi liberi sulla funzione carbossilica e sulla funzione amminica vengono recuperati in tempi brevi ed in ottime rese. La nuova procedura è stata applicata con ottimi risultati, anche, su peptidi contenenti amino acidi protetti in catena laterale con gruppi protettori acido-labili. Inoltre, è stato studiato l’andamento stereochimico della reazione di deprotezione mediante risonanza magnetica nucleare (1H-NMR). I dati 1H-NMR di miscele di prodotti diastereoisomerici tra di loro indicano chiaramente che le condizioni adottate non causano epimerizzazione degli stereocentri presenti nei substrati di partenza. Nel mio lavoro di ricerca mi sono occupata, inoltre, dello sviluppo di nuove metodologie per la sintesi di amminoacidi N-alchilati, utili building blocks per la sintesi di peptidi biologicamente attivi. In questo campo è stata messa a punto un' efficiente metodologia "one-pot" per l’ N-alchilazione di una serie di N-arilsolfonil-α-amminoacidi metil esteri recanti sostituenti diversi in posizione 4 dell'anello aromatico solfonammidico. In particolare, si è confrontata la reattività di queste specie con diazometano e trimetilossonio tetrafluoroborato in processi di N-metilazione e con trietilossonio tetrafluoroborato in processi di N-etilazione. La metilazione con diazometano ha avuto esito negativo per i derivati N-arilsolfon-ammidici contenenti gruppi elettron-donatori sull'anello aromatico. In questi casi il trimetilossonio tetrafluoroborato si è mostrato il reagente di scelta per la N-metilazione diretta e quantitativa. Il trietilossonio tetrafluoroborato ha dimostrato essere un reagente molto efficace per la preparazione di N-etil derivati di tutti gli N-arilsolfonil-α-ammino acidi metil esteri testati. Nell’ultima parte del mio lavoro di ricerca mi sono occupata del riconoscimento e della misura di analiti contenuti in matrici di interesse alimentare. Nella carne il contenuto di amminoacidi liberi ed il contenuto di acidi grassi liberi sono due parametri importanti utilizzati per determinare la sua qualità. Questi composti hanno un ruolo molto importante nella definizione delle caratteristiche sensoriali dei prodotti a base di carne. E' stata sviluppata, a tale proposito, una procedura innovativa per la misurazione del contenuto di amminoacidi e acidi grassi liberi nella carne e nei prodotti a base di carne. La procedura messa a punto prevede un singolo esperimento per la determinazione simultanea del profilo degli acidi grassi e degli amminoacidi. Gli analiti di interesse sono rapidamente estratti dalla matrice carnea e derivatizzati usando il metil cloroformiato. Questo reagente consente la trasformazione dei due gruppi di analiti nei corrispondenti N-metilossicarbonil aminoacidi metil esteri ed esteri metilici degli acidi grassi, che possono essere facilmente estratti per la loro successiva identificazione e quantificazione. La misurazione dei derivati degli acidi grassi e degli amminoacidi ottenuti viene eseguita mediante GC/MS. Il principale vantaggio del protocollo messo a punto è la determinazione simultanea di due importanti classi di analiti che sono di grande importanza nell'analisi e caratterizzazione degli alimenti. In un altro lavoro sono poi stati messi a confronto alcuni parametri importanti quali il contenuto di amminoacidi liberi e ammine biogeniche di prodotti a base di carne stagionati industriali e fatti in casa. A questo scopo, la "soppressata" e la salsiccia", due tipici salumi stagionati prodotti nel Sud Italia, sono stati analizzati. Le salsicce fatte in casa hanno mostrato un livello più alto di ammine biogeniche libere rispetto al contenuto dei prodotti industriali, molto probabilmente perché la formazione di ammine biogeniche nei prodotti industriali è limitata dall'uso di colture starter. Le salsicce industriali sono caratterizzate, invece, da un più alto contenuto di amminoacidi liberi totali.