Cardiac plasticity in fish: the influence of humoral and environmental factors

Abstract

Il rimodellamento cardiaco è un fenomeno complesso che permette un’adeguata attività d’organo in risposta a cambiamenti fisiologici e patologici e coinvolge modificazioni a livello tissutale, cellulare e molecolare, secondo meccanismi ancora poco noti. Il cuore dei vertebrati mostra una notevole capacità di adattarsi funzionalmente alle richieste emodinamiche dell’organismo. Questa plasticità è esemplificata dalla modulazione “beat-to-beat” della contrattilità in risposta a cambiamenti del carico pressorio e volumetrico (risposta di Starling) e dal riarrangiamento morfo-funzionale adattativo. I maggiori determinanti della risposta plastica del cuore sono gli stimoli fisici come lo stress meccanico e lo stiramento dei miociti, o chimici, come ad esempio quelli esercitati da cardiomodulatori, inclusi i Peptidi Natriuretici (NPs), l’endotelina-1 (ET-1), l’Ossido Nitrico (NO) e l’Angiotensina II (AngII). Queste molecole attivano specifici circuiti endocrini/paracrini/autocrini responsabili del controllo omeostatico della funzione e della crescita cardiaca. Nei mammiferi, il cuore adulto è considerato un organo terminalmente differenziato nel quale la crescita e il rimodellamento avvengono per ipertrofia. Questo paradigma è stato recentemente confutato da evidenze che mostrano come, durante la normale crescita cardiaca, i miocardiociti adulti proliferano e muoiono. L’identificazione di stimoli e meccanismi che, attivando programmi genetici e/o metabolici silenti, possano permettere ai cardiomiociti di mammifero adulto di proliferare, è al momento tra gli scopi più importanti della ricerca cardiovascolare moderna. A tal riguardo un possibile approccio è quello di identificare esempi di plasticità cardiaca fra i vertebrati. Negli ultimi anni il cuore dei pesci ha rappresentato un importante strumento di ricerca per analizzare aspetti molecolari, cellulari e tissutali della plasticità cardiaca. Nei pesci, il cuore adulto conserva la capacità di crescita iperplastica in risposta a cambiamenti delle condizioni ambientali, all’esercizio fisico e alla maturità sessuale. Esempio estremo di questa plasticità è rappresentato dalla completa rigenerazione del cuore di zebrafish in seguito a rimozione chirurgica di una porzione del ventricolo. In una prospettiva traslazionale, i risultati di studi effettuati nei pesci potrebbero rappresentare uno strumento importante per decifrare i determinanti e i meccanismi coinvolti nel rimodellamento morfo-funzionale del cuore dei mammiferi. Partendo da queste premesse, questo progetto di tesi ha voluto valutare se e in che misura, fattori umorali e ambientali influenzano la plasticità cardiaca dei pesci. In particolare, in questa tesi di dottorato sono riportati e discussi i risultati ottenuti da studi relativi al controllo umorale del rimodellamento morfo-funzionale cardiaco mediato dall’esposizione cronica all’AngII nel cuore dell’anguilla europea Anguilla anguilla e dello zebrafish Danio rerio, e i meccanismi fisiologici e molecolari attivati nel cuore della carpa, Carassius carassius, in risposta all’ipossia. L’AngII, il prodotto bioattivo del Sistema Renina Angiotensina (RAS) è un potente ormone le cui azioni biologiche sono state ampiamente studiate nei mammiferi. A livello cardiaco, legandosi a recettori di tipo AT1 e AT2, l’AngII influenza positivamente la contrattilità miocardica e regola la crescita miocitaria. Un RAS omologo a quello dei mammiferi è presente anche nei pesci. In particolare, nei teleostei, l’AngII può indurre modificazioni cardiache a breve (modulazione della contrattilità) e lungo termine (rimodellamento morfo-funzionale). Nel 2013, Imbrogno e collaboratori hanno dimostrato che il cuore di anguille esposte per 4 settimane ad iniezioni intraperitoneali di AngII mostrava una migliore capacità di rispondere ad incrementi di post-carico. Quest’effetto era mediato dall’attivazione dei recettori AT2 e accompagnato da una differente espressione e localizzazione di proteine coinvolte nella regolazione della crescita e dell’apoptosi. Partendo da queste premesse, questo studio ha voluto meglio investigare le modificazioni strutturali e molecolari attivate nel cuore di anguille esposte per 8 settimane ad iniezioni intraperitoneali di AngII. Analisi morfologiche hanno evidenziato che i cuori di animali trattati mostravano un incremento della muscolarità ventricolare associato ad un aumento dello spessore del compatto e ad una riduzione degli spazi lacunari nello spugnoso. Queste modificazioni erano accompagnate da un’incrementata vascolarizzazione del compatto. Analisi di western blotting e immunofluorescenza hanno evidenziato un’aumentata espressione del recettore AT2 nei cuori di animali trattati, associata ad una diversa localizzazione: nei controlli AT2 localizza principalmente a livello miocitario mentre in seguito a trattamento, un segnale fluorescente si osserva a livello dell’endotelio endocardico. In relazione al ruolo cruciale svolto dallo NO nei meccanismi di regolazione del rimodellamento cardiaco nei pesci, lo studio ha voluto anche analizzare il cross-talk tra AngII e il sistema NO Sintasi (NOS)/NO. In condizioni basali, lo NO prodotto dalla NOS viene immediatamente metabolizzato a nitriti o nitrati. Per questa ragione, il dosaggio dei nitriti può essere utilizzato per misurare i livelli di NO prodotti dalla NOS e di conseguenza la funzionalità stessa dell’enzima. Il dosaggio dei nitriti, effettuato su omogenati di cuori di animali trattati con AngII ha evidenziato una riduzione significativa della concentrazione di nitriti rispetto ai controlli, indice di una ridotta attività della NOS. Analisi di western blotting non hanno evidenziato variazioni significative nei livelli di espressione della forma fosforilata (e quindi attiva) della NOS. Tuttavia, il trattamento ha influenzato la localizzazione dell’enzima fosforilato. Infatti, mentre nei controlli peNOS localizza sia nei miociti che a livello dell’endotelio endocardico (EE), nei trattati si osserva una maggiore localizzazione a livello miocitario e solo un debole segnale a livello endocardico. Questo dato è accompagnato da una maggiore espressione, a livello dell’EE, di NOSTRIN, un modulatore negativo della NOS, responsabile della traslocazione dell’enzima dalla membrana plasmatica all’interno di vescicole citoplasmatiche. Analisi di western blotting hanno anche evidenziato una riduzione nei livelli di espressione della chinasi Akt e dello chaperone HSP90, due tra i principali modulatori positivi della NOS. Nel complesso questi risultati dimostrano che il cuore di anguilla cronicamente esposto all’azione dell’AngII va incontro ad un riarrangiamento strutturale e ad una modulazione dei livelli di NO e delle proteine che regolano l’attività della NOS. Gli effetti cronici dell’AngII sono stati investigati anche nello zebrafish. Sebbene questo studio è ancora in corso, i primi risultati sperimentali dimostrano che anche il cuore di zebrafish va incontro ad un rimodellamento strutturale se esposto per 8 settimane all’azione dell’AngII. In particolare, i cuori trattati con AngII mostrano un incremento del compatto e una riduzione degli spazi lacunari, indicativi di un aumento della muscolarità ventricolare. Questo è associato ad un aumento del collagene e ad un significativo aumento del peso del cuore e dell’indice cardiosomatico (rapporto in percentuale tra il peso del cuore e il peso dell’animale). Analisi di western blotting hanno evidenziato inoltre un’aumentata espressione di entrambi i recettori AT1 e AT2 in omogenati cardiaci di animali trattati con AngII. La seconda parte della tesi ha analizzato i meccanismi fisiologici e molecolari attivati nella carpa in risposta all’ipossia. A differenza dei mammiferi, alcune specie di pesci, come ad esempio i ciprinidi, mostrano una notevole capacità di sopravvivere e restare attivi anche per lungo tempo se esposti a condizioni di ipossia o anossia. Questa capacità è legata alla loro abilità di mantenere o aumentare la performance cardiaca in risposta ad una riduzione di ossigeno ambientale, favorendo così gli scambi tra i tessuti. Inoltre, questi pesci sono in grado di convertire il lattato (prodotto ultimo della glicolisi) in etanolo, che è poi eliminato attraverso le branchie. Una caratteristica dei pesci è la loro capacità di captare, attraverso le branchie, nitriti e nitrati dall’acqua in cui si trovano; in condizioni di ipossia, quando l’attività della NOS è compromessa, i nitriti possono rappresentare un’importante fonte di NO che, a sua volta, interviene nei processi di citoprotezione. Sulla base di queste osservazioni, in collaborazione con il Prof. Jensen (Università di Odense) e la Prof.ssa Fago (Università di Aarhus), è stato avviato uno studio volto a valutare il ruolo dei nitrati e della mioglobina come fonti alternative di nitriti, e quindi di NO, nella carpa esposta per un giorno ad ipossia profonda (1<PO2<3 mmHg). Omogenati cardiaci e di muscolo rosso e bianco hanno evidenziato un aumento di nitriti e di altri metaboliti dello NO, quali Fe-nitrosile (FeNO) S-nitroso (SNO) e N-nitroso (NNO), sia nel cuore che nel muscolo rosso di carpe esposte ad ipossia. Questo incremento non era correlato a differenze nelle concentrazioni di mioglobina. Il dosaggio dell’attività nitrato reduttasica tissutale in omogenati di cuore, muscolo bianco e fegato, ha inoltre evidenziato che in condizioni di ipossia profonda, il muscolo e il fegato sono in grado di convertire il nitrato esterno in nitrito. Questa attività non è stata riscontrata nel cuore, dove risulta invece evidente una riduzione nelle concentrazioni di nitriti in risposta all’ipossia. Questi risultati supportano il ruolo dei nitriti come fonte alternativa per la generazione di NO durante l’ipossia; questo risulta maggiormente evidente in tessuti ricchi in mioglobina e mitocondri come il cuore, dove la conversione di nitriti a NO potrebbe rappresentare un importante meccanismo di cardioprotezione. Inoltre, in condizioni ipossiche, l’attività nitrato reduttasica riscontrata nel muscolo e nel fegato degli animali esposti ad ipossia potrebbe essa stessa supplementare le riserve intracellulari di nitriti contribuendo alla citoprotezione. In conclusione, i risultati riportati in questa tesi suggeriscono che se esposto a influenze umorali o ambientali il cuore dei pesci va incontro ad un significativo rimodellamento molecolare, strutturale e fisiologico. Sebbene molto resti ancora da chiarire sui meccanismi molecolari attivati, questi risultati indicano chiaramente un ruolo chiave svolto dal sistema NOS/NO come principale coordinatore/integratore di cascate molecolari che controllano le risposte cardiache adattative nei pesci. Ricerche future contribuiranno a meglio decifrare i complessi networks molecolari coinvolti nella plasticità cardiaca di questi vertebrati. In questo contesto, la scelta di modelli sperimentali appropriati, caratterizzati da una marcata adattabilità morfofunzionale ad una varietà di stimoli ambientali (temperatura, pH, pressione parziale di ossigeno, etc.) potrà essere di grande aiuto.