Targeting systems vulnerabilities in uveal melanoma by CRISPR Cas/9 focal adhesion kinase (FAK) genome editing and therapeutic inhibition

Abstract

Il Melanoma Uveale rappresenta la neoplasia intraoculare più frequente nell’età adulta. Colpisce circa 2,500 individui ogni anno negli USA ed il 50% dei pazienti affetti da tale neoplasia sviluppa metastasi entro 5 anni dalla diagnosi. Non essendo state ancora identificate terapie efficaci, la sopravvivenza in presenza di metastasi è di circa 6 mesi. Il Melanoma Uveale è geneticamente caratterizzato dalla presenza di mutazioni somatiche attivanti a carico degli oncogeni GNAQ e GNA11, che codificano per due diverse subunità α delle proteine G. Tali mutazioni sono state identificate rispettivamente in circa il 94% dei casi di Melanoma Cutaneo ed il 4% dei casi di Melanoma Uveale. Sulla base di tali osservazioni, nel presente lavoro di tesi è stato valutato il ruolo esercitato da una proteina citoplasmatica ad attività tirosin-chinasica associata ai recettori per le integrine denominata FAK (focal adhesion kinase), nella progressione del Melanoma Uveale, sia in vitro che in vivo. In particolare, mediante analisi bioinformatica (www.cbioportal.com) delle alterazioni genomiche di campioni estratti da pazienti affetti da melanoma uveale (n=80), è stato inizialmente determinato che il gene codificante per FAK (PTK2) risulta over-espresso nel 56% dei casi. Inoltre, il presente studio condotto in cellule di Melanoma Uveale OMM1.3 (GNAQ/11 mutate) e in cellule ingegnerizzate per l’espressione di un recettore di membrana accoppiato a proteine-G (Gαq) attivato esclusivamente da ligandi sintetici denominate HEK293 DREADD/Gq, ha dimostrato il coinvolgimento di segnali mediati da GNAQ nell’attivazione di FAK attraverso il reclutamento del fattore coinvolto nello scambio di nucleotidi guaninici denominato TRIO e la proteina appartenente alla super-famiglia di Ras denominata Rho-A. A riprova, saggi biologici hanno dimostrato l’efficacia di specifici inibitori di FAK nei processi di proliferazione cellulare sia in cellule di Melanoma Uveale derivanti da lesioni primarie che da metastasi epatiche. Attraverso l’innovativo approccio genetico denominato CRISPR/Cas 9 genome editing (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), il silenziamento dell’espressione di FAK ha ridotto significativamente la crescita del melanoma uveale in modelli sperimentali utilizzati in vivo. Collettivamente, i risultati ottenuti indicano che FAK può essere considerato un potenziale target terapeutico per il trattamento del Melanoma Uveale e di altre neoplasie caratterizzate da mutazioni oncogeniche a carico delle subunità αq/α11 dei recettori di membrana accoppiati a proteine G.