New natural statin-like compounds with anticholesterolemic and antiproliferative properties: "in vitro and in vivo studies"

Abstract

Il rischio di malattia coronaria è aumentato negli individui che mostrano elevata concentrazione di colesterolo nelle lipoproteine plasmatiche a bassa densità (LDL). E’ stato dimostrato che l’inibizione del 3-idrossi-3-metilglutaril-CoA reduttasi (HMGR), enzima che catalizza la conversione di HMG-CoA in mevalonato (MVA), tappa limitante la velocità di biosintesi del colesterolo, è l’approccio più efficace per la diminuzione plasmatica di LDL e la riduzione del tasso di eventi cardiovascolari. Come parte di un meccanismo compensatorio, alla deplezione di colesterolo nel fegato, dovuto all’inibizione dell’enzima HMGR, segue l’aumento della produzione di recettori per le LDL e il successivo smaltimento di LDL dalla circolazione sistemica. Gli inibitori di HMGR rappresentano la classe di farmaci più efficaci e maneggevoli per la riduzione della concentrazione di LDL. Sebbene le statine siano gli inibitori di HMGR più largamente prescritti, sono associate a spiacevoli effetti collaterali quali severa miopatia e perdita della memoria statinoassociata. In questo contesto l’identificazione di nuovi composti statino-simili, che agiscono come inibitori di HMGR, risulta utile per superare le limitazioni già descritte. E’ stato dimostrato che alcuni composti naturali, che si ritrovano nella nostra dieta, hanno proprietà terapeutiche e farmacologiche. In particolare studi condotti in seguito a somministrazione cronica di succo di alcune specie di Citrus hanno confermato che questa strategia influenza positivamente i livelli plasmatici dei lipidi e può essere associata alla riduzione del rischio di malattia coronarica. Durante questo lavoro di tesi , l’attenzione è stata rivolta allo studio di due flavonoidi, statino-simili, (brutieridina e melitidina) estratte dal bergamotto (Citrus bergamia), ma presenti anche in altre specie del genere Citrus. Come molecola di riferimento è stata considerata la statina commerciale più prescritta nell’uomo, la simvastatina. Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando una frazione arricchita delle due molecole (EF) ed una purificata (BMF), al 99%. I composti testati, sono stati isolati e caratterizzati in maniera esaustiva, mediante spettrometria di massa e risonanza magnetica, dal gruppo di ricerca del Prof. G. Sindona (Dip.to di Chimica, Università della Calabria). In particolare, si è valutata “in vivo”, l’attività ipocolesterolemica e ipolipidemica delle frazioni oggetto di studio. In primo luogo è stato ottenuto un modello animale ipercolesterolemico, in seguito al trattamento degli animali (ratti) con una dieta opportuna. Successivamente, sul modello ottenuto è stato monitorato il metabolismo del colesterolo, mediante la valutazione del livello di espressione dei geni codificanti l’enzima HMGR ed il recettore delle LDL, sia a livello di trascritto che a livello proteico. Il metabolismo dei trigliceridi, invece, è stato monitorato valutando il livello di trascritto e di proteina del gene che codifica per il principale enzima della sintesi degli acidi grassi e quindi dei trigliceridi, il gene FASN. Inoltre sono stati valutati i livelli di colesterolo e di trigliceridi nel fegato e nel sangue ed è stata determinata sia l’attività di HMGR che quella di due enzimi coinvolti nella lipogenesi, in quanto responsabili della produzione di NADPH, utilizzato per la sintesi degli acidi grassi e del colesterolo, enzima malico e isocitrato deidrogenasi. I risultati ottenuti hanno evidenziato, nei ratti trattati con BMF, una riduzione dei livelli di colesterolo e dei trigliceridi, sia a livello epatico che sierico, tale decremento è risultato essere ancora più evidente nei ratti trattati con EF, rispetto ai controlli ipercolesterolemici. Dalla valutazione dei livelli di trascrizione di due principali proteine coinvolte nel metabolismo del colesterolo, HMGR ed LDLR e dell'enzima principale della biosintesi degli acidi grassi, FASN, è emerso chiaramente che il comportamento di BMF è simile a quello della simvastatina, uno dei farmaci ipocolesterolemici più utilizzati. Infine, dalla valutazione dell’attività degli enzimi HMGR, isocitrato deidrogenasi citoplasmatica ed enzima malico, negli epatociti degli animali trattati con le due frazioni rispetto a quella evidenziata negli epatociti dei ratti controllo, è stata riscontrata un’inibizione, anche in questo caso, paragonabile a quella osservata per i ratti trattati con simvastatina. Attraverso lo studio condotto è stato dimostrato che le due molecole estratte dal bergamotto, brutieridina e melitidina, sono dotate di attività ipocolesterolemica, dovuta all’azione inibitoria esercitata nei confronti dell’enzima HMGR. L’interesse scientifico inoltre, è stato quello di valutare “in vitro”, l’aspetto anti-proliferativo ed antinfiammatorio dei due flavonoidi studiati. Infatti, in letteratura è riportato che le statine sintetiche riducono la proliferazione di un’ampia varietà di tipi cellulari, “in vitro”, inducendo l’arresto del ciclo cellulare nella fase G1. Questa sperimentazione è stata condotta su cellule di carcinoma mammario umano, MCF7, utilizzando la frazione purificata (BMF) e comparando i risultati con quelli ottenuti dopo trattamento di cellule della stessa linea con simvastatina (profarmaco precedentemente utilizzato per gli studi “in vivo”) e pravastina. Il lavoro svolto ha previsto, in primo luogo, la creazione di una linea tumorale, stabile, che fosse in grado di over-esprimere il gene HMGCR (MCF-7-HMGCR), utilizzando un metodo di trasfezione virale; successivamente è stata valutata l’attività proliferativa delle cellule tumorali (MCF-7); delle cellule tumorali trasfettate con il gene HMGCR (MCF-7-HMGCR) e di quelle epiteliali non tumorali (fibroblasti hTERT-BJ1), dopo trattamento con BMF, pravastatina e simvastatina. I risultati ottenuti hanno dimostrato che alte concentrazioni di BMF svolgono un’azione antiproliferativa meno elevata di quella riscontrata con concentrazioni più basse di simvastatina. Tuttavia è doveroso sottolineare che mentre BMF e pravastatina non inibiscono la proliferazione cellulare, nelle cellule non tumorali, la simvstatina è risultata essere tossica anche a basse concentrazioni. Mediante analisi con XFe96 Seahorse Analyzersi è effettuata la valutazione metabolica delle linee cellulari MCF-7, MCF-7-HMGCR, hTERT-BJ1. I risultati ottenuti hanno evidenziato un’aumentata respirazione mitocondriale (OCR) nella linea MCF-7-HMGCR rispetto alla MCF-7; nessuna differenza in termini di funzione glicolitica (ECAR) è stata, invece, riscontrata tra le due linee cellulari. Inoltre, la respirazione mitocondriale, in cellule MCF-7-HMGCR, dopo trattamento con BMF, ha evidenziato una riduzione della produzione di ATP e una diminuzione della respirazione massimale e della capacità respiratoria cellulare. Infine, le analisi OCR su cellule hTERT-BJ1 dopo trattamento con BMF, pravastatina e simvastatina hanno sottolineato una riduzione della respirazione mitocondriale minima, nelle cellule trattate con pravastatina; tale riduzione è risultata essere più marcata nelle cellule trattate con simvastatina. Nessuna differenza è stata, invece, riscontrata nelle cellule trattate con BMF. Questi risultati hanno confermato una leggera tossicità nelle cellule hTERT-BJ1 trattate con pravastatina ed una marcata tossicità in quelle trattate con simvastatina, a differenza delle cellule trattate con BMF. Inoltre, l’indagine effettuata su diversi pathways, implicati nella proliferazione cellulare e nell’infiammazione, ha evidenziato un potenziale effetto antinfiammatorio e antiossidante di BMF, come sottolineato da un aumento della risposta antiossidante e di quella immunitaria regolate dall’interferone I, da una diminuzione della risposta infiammatoria mediata dall’interferone-gamma e da una down-regolazione della via infiammatoria regolata dal gene STAT3, in cellule MCF-7, trattate con BMF. Il trattamento con BMF ha determinato, inoltre, la down-regolazione di due pathways coinvolti nella proliferazione tumorale e nella formazione di CSCs (cancer stem cells), regolati da Notch e Wnt. Questi risultati hanno portato ad indagare su un’eventuale coinvolgimento di BMF, nella formazione di mammospheres e a dimostrare, dopo trattamento con BMF, un decremento nella efficienza di formazione di mammospheres, dose dipendente, più marcato nelle cellule che over-esprimono l’enzima HMGCR. Successivamente, è stata riscontrata, per BMF, la capacità di ridurre lo stress ossidativo, la formazione di radicali liberi e la successiva risposta pro-infiammatoria, come evidenziato dalla diminuizione dell’espressione delle citochine pro-infiammatorie, regolata dal complesso proteico NF-kB e dalla diminuizione dell’espressione dei fattori inducibili l’ipossia, regolata dal gene HIF, riscontrate in cellule hTERT-BJ1, trasfettare con i gene reporter Nf-KB e HIF e trattate con BMF. Infine è stato valutato l’effetto antinfiammatorio ed antiossidante della frazione purificata di brutieridina e melitidina; dai risultati ottenuti è stato possibile evincere una riduzione dei fattori di stimolazione, coinvolti nella formazione dei granulociti e dei macrofagi, in cellule MCF-7 trattate con pravastatina ed, in egual misura, in quelle trattate con BMF. Anche la produzione di IL-8, in cellule trattate con BMF, ha mostrato un decremento, di poco inferiore a quello riscontrato in cellule trattate con pravastatina. Infine la riduzione di cancer stem cells (CSC) è stata valutata tramite l’impiego di un marker specifico (ALDH) che ha permesso di isolare la popolazione ALDEFLUOR-positiva relativa alla popolazione staminale, in cellule MCF7. Dopo trattamento con BMF e pravastatina, è emersa una netta diminuzione della popolazione ALDEFLUOR-positiva, nella linea cellulare MCF7. Pertanto, l’aggiunta di colesterolo (prodotto della biosintesi del mevalonato) al mezzo cellulare, in presenza di BMF e/o pravastatina , non ha cambiato la percentuale di riduzione della popolazione di CSCs. Al contrario l’aggiunta di mevalonato al mezzo di coltura, ha riportato sia il numero di mammospheres che la percentuale della popolazione di CSCs ai valori del controllo. Questi risultati hanno permesso di indicare la BMF come un composto con scarsa tossicità e capace di prevenire la crescita tumorale, l’espansione tumorale mediata da fattori pro-infiammatori e la fomazione di CSCs. L’impiego della BMF in concomitanza ai canonici chemioterapici, potrebbe migliorare l’effetto degli stessi e diventare un nuovo target drug nella terapia add-on.