<<The>> role of intrinsic and extrinsic signals in the regulation of brest cancer stem cell activity

Abstract

Il carcinoma mammario rappresenta la neoplasia a maggiore incidenza nel sesso femminile. Nonostante i numerosi progressi da un punto di vista diagnostico e terapeutico, metastasi e recidiva tumorale rappresentano ancora le principali cause di morte nelle pazienti affette da carcinoma mammario. Recentemente, numerosi studi hanno suggerito la presenza di una sottopopolazione di cellule con caratteristiche di staminalità chiamate cellule staminali tumorali (CSCs), che svolgono un ruolo importante nel sostegno della crescita e della progressione tumorale. Le CSCs, così come le cellule staminali normali, sono caratterizzate dalla capacità di auto-rinnovamento (self-renewal) e di differenziazione. Da un punto di vista clinico, il principale problema inerente le cellule staminali tumorali, riguarda la loro resistenza ai trattamenti convenzionali (terapia endocrina, chemio- e radioterapia), caratteristica che potenzialmente potrebbe essere la causa della recidiva tumorale e delle metastasi. Le cellule staminali del tumore mammario sono regolate sia da segnali intrinseci che da segnali estrinseci derivanti da elementi appartenenti al microambiente tumorale che le circonda, la cosiddetta “nicchia” delle cellule staminali tumorali. Tra i segnali intrinseci, i pathways embrionali, come Notch, Wnt e Hedgehog risultano frequentemente deregolati nel carcinoma mammario. In particolare, il segnale di Notch4 svolge un ruolo di notevole importanza nel contesto della staminalitá in quanto la sua attivitá risulta essere significativamente più elevata in cellule staminali di carcinoma mammario rispetto alle cellule tumorali differenziate e la sua inibizione riduce la crescita delle mammosfere e la formazione della massa tumorale in vivo. Il microambiente tumorale costituito da cellule mesenchimali staminali, adipociti, fibroblasti associati al tumore, cellule endoteliali e immunitarie, regola la staminalità, la proliferazione e la resistenza all’apoptosi delle cellule staminali attraverso la secrezione di citochine e fattori di crescita. Nel contesto del microambiente mammario, gli adipociti costituiscono la componente cellulare più abbondante e insieme ai loro fattori secreti, rappresentano i principali protagonisti nelle interazioni tra cellule stromali ed epiteliali. Tra i fattori secreti l’adipochina leptina svolge un ruolo chiave nella tumorogenesi mammaria. Inoltre, dati recentemente pubblicati dal nostro gruppo di ricerca, hanno identificato la leptina, come il principale regolatore del cross-talk tra cellule tumorali mammarie e fibroblasti associati al tumore (CAFs), aggiungendo, per la prima volta, la leptina all'elenco dei fattori di crescita in grado di mediare l’interazione tra tumore e stroma. Pertanto, sulla base di tali osservazioni, l’attenzione è stata rivolta allo studio del possibile ruolo dei fattori secreti dal microambiente tumorale, in particolare della leptina, e dei fattori intrinseci, in particolare di Notch4, nell’influenzare il comportamento fenotipico delle BCSCs. Al fine di valutare il ruolo del microambiente tumorale nella modulazione dell’attività staminale delle cellule di carcinoma mammario, sono stati utilizzati fibroblasti associati al tumore e adipociti maturi, come modelli sperimentali per le cellule stromali e cellule ER+ MCF-7 e ER- MDA-MB-231 come modello di cellule epiteliali di carcinoma mammario. Negli esperimenti di co-coltura, la presenza dei mezzi condizionati ha indotto una maggiore formazione delle mammosfere rispetto alle condizioni di base, suggerendo come fattori secreti dalle cellule stromali possano influenzare l’attività delle BCSCs. Tale risultato è completamente reversato in presenza dei mezzi condizionati depleti della leptina, individuando l’adipochina come mediatore cruciale negli effetti delle cellule stromali sulle BCSCs. Inoltre, sono stati testati gli effetti di un peptide con attività antagonista sul recettore leptinico (ObR), sintetizzato in collaborazione con il laboratorio di Chimica Organica diretto dal Prof. Liguori, sulle cellule di carcinoma mammario cresciute come mammosfere. I risultati ottenuti hanno dimostrato che, antagonizzando il recettore leptinico, l’aumentata formazione di mammosfere indotta dai mezzi condizionati stromali, è significativamente ridotta in presenza del peptide, confermando l’importanza dell’interazione leptina-ObR nel sostegno della crescita delle BCSCs. Al fine di confermare i risultati ottenuti, sono stati valutati gli effetti diretti del segnale leptinico nel mantenimento delle proprietà staminali delle cellule di carcinoma mammario. In primo luogo, è stato osservato che i livelli di mRNA del recettore della leptina risultano maggiormente espressi nelle mammosfere rispetto alle cellule coltivate in adesione. Inoltre il trattamento con leptina è in grado di aumentare significativamente la formazione delle mammosfere, il self-renewal e la popolazione con fenotipo CD44+/CD24- rispetto alle condizioni di controllo, suggerendo che tale adipochina sia direttamente coinvolta nell’induzione dell’attività staminale delle cellule di carcinoma mammario. Successivamente, analisi di microarray condotta in cellule MCF-7 cresciute come mammosfere, ha rivelato che tra i geni differentemente espressi tra il trattamento con leptina e con i mezzi condizionati delle cellule stromali, molti risultano correlati con il fenotipo staminale e con la regolazione del ciclo cellulare. È stato inoltre riscontrata una significativa up-regolazione dei geni codificanti per le heat shock proteins (HSPs), la cui attività è ormai noto essere implicata nei processi di carcinogenesi e di resistenza terapeutica in molti tipi tumorali. In seguito, gli effetti biologici della leptina sono stati saggiati in vivo, utilizzando cellule epiteliali tumorali estratte dai fluidi metastatici (liquido di drenaggio pleurico o ascitico) provenienti da pazienti con carcinoma mammario. I risultati ottenuti dimostrano che la leptina è in grado di aumentare in maniera significativa il numero di mammosfere formate rispetto alle condizioni di controllo in tutti i campioni utilizzati, e tali effetti sono completamente reversati in presenza del peptide. Come parte finale di questo studio, è stata analizzata, in diversi pazienti con carcinoma mammario (n=781), la relazione tra l’espressione genica di ObR e/o HSP90 con l’overall survival mediante analisi di Kaplan-Meier. I risultati hanno evidenziato come le pazienti con elevata espressione di ObR e di HSP90 presentano una ridotta sopravvivenza, suggerendo un loro potenziale ruolo come fattori prognostici. Successivamente è stato valutato il ruolo dei segnali intrinseci, in particolare di Notch4, nella modulazione dell’attività delle cellule staminali di carcinoma mammario nel contesto della resistenza alla terapia endocrina. In primo luogo, sono stati valutati gli effetti degli anti-estrogeni, tamoxifene e fulvestrant, sull’attività staminale, utilizzando come modelli sperimentali cellule epiteliali isolate da tumori mammari ER+, primari e metastatici. I risultati ottenuti hanno dimostrato che l’esposizione al tamoxifene è in grado di aumentare significativamente il self-renewal nella maggior parte dei campioni utilizzati. Successivamente, analisi citofluorimetriche hanno rivelato che l’attività enzimatica dell’ALDH, un altro noto marcatore di staminalità, è significativamente incrementata in seguito al trattamento con tamoxifene e fulvestrant nei campioni isolati da pazienti con tumore mammario, in modelli PDX e linee cellulari ER+. Tali dati suggeriscono che gli anti-estrogeni, somministrati per un breve periodo di tempo, sono responsabili di un’aumentata popolazione di cellule con attività staminale. In seguito, è stato osservato che l’esposizione al tamoxifene e al fulvestrant a breve termine, in modelli PDX e in cellule di carcinoma mammario recettore estrogenico positive (MCF-7, T47D, e ZR-75-1), induce un’aumentata espressione di HEY1 and HES1, geni target di Notch. Inoltre, in cellule MCF-7 resistenti al tamoxifene (TAMR) ed al fulvestrant (FULVR), generate dopo un’esposizione prolungata a tali trattamenti endocrini, è stata riscontrata un’up-regolazione dei geni target di Notch, così come una sua aumentata attività trascrizionale. Analisi di Western Blot, hanno successivamente rivelato che tra i diversi componenti della famiglia dei recettori di Notch, l’espressione di Notch4 e del suo dominio intracellulare attivo (ICD) risultano significativamente incrementate nei modelli resistenti rispetto alle cellule parentali. Inoltre, l’espressione di NOTCH4 e del suo ligando JAG 1 risultano up-regolate dal trattemento a breve termine con tamoxifene e fulvestrant sia in vivo che in vitro, suggerendo come l’attivazione di tale segnale possa rappresentare un evento iniziale nell’acquisizione della resistenza endocrina. Al fine di comprendere meglio il ruolo di NOTCH4 in tale contesto, sono stati generati cloni knock-out, utilizzando una metodica di editing genomico, recentemente descritta, chiamata CRISPR cas9. L’avvenuto knock-out, confermato mediante saggi di genotipizzazione e analisi di Western Blot, ha indotto nelle cellule MCF-7, una significativa inibizione della formazione delle mammosfere, così come una ridotta popolazione ALDH+, effetto ancora più evidente in seguito a trattamento con tamoxifene e fulvestrant. Infine, il segnale di Notch4 è stato inibito mediante l’utilizzo dell’inibitore delle gamma secretasi, RO4929097, ed è stata valutata successivamente l’attività staminale e il potere tumorigenico in vivo. I risultati ottenuti dimostrano che, nei modelli PDX, RO4929097 è in grado di abrogare l’induzione della formazione delle mammosfere, dell’attività dell’ALDH e la capacità tumorigenica, stimolate dal trattamento con anti-estrogeni. In conclusione, i risultati ottenuti in tale lavoro di tesi, identificano la leptina come un importante fattore estrinsico che media l'interazione tra le cellule stromali e le BCSCs. Inoltre, i nostri dati sottolineano l’importanza di Notch4, come fattore intrinsico, nella regolazione dell’attività staminale delle cellule di carcinoma mammario indotta dal trattamento con anti-estrogeni. Da un punto di vista clinico, tali dati suggeriscono come le strategie terapeutiche volte ad inibire il segnale leptinico e il segnale di Notch4 potrebbero rappresentare un valido approccio per l’eradicazione delle BCSCs, riducendo i fenomeni di resistenza, metastasi e di conseguenza la mortalità delle pazienti con carcinoma mammario.