Study of two epigenetic age-associated modifications: DNA methylation of the rRNA gene promoter in humans and histone tail acetylation at the subtelomeric region in S. cerevisiae

Abstract

Il presente lavoro di tesi è stato realizzato in parte presso il laboratorio di genetica dell'Università della Calabria, sotto la supervisione della Professoressa Dina Bellizzi e in parte presso la Davis School of Gerontology, in collaborazione con il Professor Valter Longo direttore del USC Longevity Institute. L'invecchiamento è un processo complesso. I fenotipi d’invecchiamento variano da organismo a organismo, ma un generale declino fisiologico si realizza con l’avanzare dell'età. Una correlazione tra modificazioni epigenetiche e invecchiamento è stato proposto molti anni fa, e nel corso degli anni molteplici studi hanno fornito le prove dell’esistenza di tale connessione, suggerendo che si tratta di un fenomeno conservato lungo il processo evolutivo. In questo lavoro sono stati investigati due dei più importanti meccanismi epigenetici associati all’invecchiamento: la metilazione del DNA e l’acetilazione degli istoni. È noto che a livello globale la metilazione del DNA tende a diminuire nel corso dell’invecchiamento, con un concomitante aumento, invece, ai promotori di specifici geni. Presso il laboratorio di genetica dell’Università della Calabria è stata investigata la presenza di citosine metilate in siti CpG all’interno della regione del promotore dei geni che codificano per l’RNA ribosomiale umano nonché l’associazione tra tali livelli, l’invecchiamento e la frailty. L’attenzione è stata focalizzata su questo sito a causa di alcune peculiari caratteristiche che esso presenta: il ruolo cruciale dell’rRNA ribosomiale nelle funzioni cellulari, l’alto livello di conservazione di questa sequenza nucleotidica lungo il processo evolutivo, nonchè l’organizzazione in cluster dei geni che codificano per l’rRNA. I livelli di metilazione sono stati valutati in campioni di sangue estratti da individui di età differente e con differenti fenotipi d’invecchiamento mediante la piattaforma Sequenom MassARRAY EpiTYPER. Dall’analisi è emersa l’esistenza di una correlazione tra i livelli di metilazione di specifici dinucleotidi CpG, presenti nel promotore genico da noi investigato, l’invecchiamento e i diversi fenotipi ad esso correlati. I risultati di questo studio sono mostrati nel Capitolo 2. Studiare l’invecchiamento negli esseri umani, tuttavia, comporta numerose difficoltà, per questa ragione sono spesso utilizzati sistemi modello. Uno dei più importanti organismi modello è il lievito Saccharomyces cerevisiae attraverso cui è stato possibile individuare numerosi geni rilevanti nel processo di invecchiamento, tra cui il gene Sir2 che codifica per un’istone deacetilasi. Sir2 è un gene associato con resistenza cellulare allo stress e con la regolazione della durata della vita sia replicativa che cronologica nel lievito. Presso il laboratorio del Prof. Longo è stato in precedenza dimostrato che Sir2 blocca l’estensione della durata della vita cronologica causata dalla restrizione calorica o da mutazioni nei pathway Tor/Sch9, Ras/cAMP/PKA e promuove, inoltre, la protezione cellulare sia contro lo stress termico che ossidativo. Evidenze crescenti dimostrano che Sir2 e la sua controparte, Sas2, regolano la durata della vita di S. cerevisiae mediante acetilazione e deacetilazione degli istoni H4K16 nella regione sub-telomerica. In questo studio, abbiamo identificato un nuovo meccanismo attraverso cui Sir2, agendo sulla regione sub-telomerica, regola la protezione contro il danno ossidativo, senza influenzare l'invecchiamento cronologico, segno che questi eventi sono regolati da pathway differenti. I dati riportati supportano i risultati ottenuti in precedenza e allo stesso tempo forniscono una spiegazione parziale del meccanismo sottostante alla maggiore resistenza mostrata dalle cellule mancanti del gene Sir2, come riportato nel Capitolo 3. Durante il periodo trascorso presso i laboratori del Longevity Institute sono stata inoltre coinvolta in un secondo progetto, dimostrando che una dieta ipocalorica e non solo il digiuno sono efficaci nel ridurre la progressione tumorale e gli effetti collaterali associati alla chemioterapia, identificando inoltre nel sistema immunitario un attore fondamentale di questo processo. Data la rilevanza di questi dati, la USC si riserva la possibilità di bloccarne la divulgazione prima della pubblicazione. Tuttavia, una breve descrizione di questo lavoro è fornita in appendice A. Nella prima parte del mio programma di dottorato di ricerca, condotta presso l'Università della Calabria, ho inoltre collaborato ad uno studio volto a risolvere il dibattito circa la possibile presenza di citosine metilate all'interno del DNA mitocondriale (mtDNA). I risultati di questo studio sono illustrati nell’articolo scientifico “The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern”, DNA Research, riportato in appendice B.