Sviluppo larvale e metamorfosi nell’ascidia Ciona intestinalis: ruolo del monossido di azoto

Abstract

Sviluppo larvale e metamorfosi nell’ascidia Ciona intestinalis: ruolo del monossido di azoto Lo sviluppo larvale e la metamorfosi dell’ascidia Ciona intestinalis rappresentano un processo molto complesso mediante il quale la larva natante si trasforma in un individuo giovane sessile attraverso una profonda ricostruzione del piano corporeo e la regressione della coda. A livello molecolare, avvengono alcuni processi quali l'attivazione della caspasi-3-simile e della MAPK (Chambon et al., 2002, 2007) e la produzione di monossido di azoto (NO) (Comes et al., 2007). In particolare, è stato dimostrato che l'espressione spaziale di ossido nitrico sintasi (NOS) e di NO è molto dinamica durante lo sviluppo di ciona. Il segnale si sposta rapidamente lungo tutta la larva coinvolgendo il sistema nervoso centrale e la coda nei suoi diversi compartimenti. Inoltre, l'NO regola la regressione della coda, agendo sulla apoptosi mediata da caspasi-3-simile. Il progetto di tesi é stato focalizzato ad uno studio approfondito del ruolo dell'NO durante lo sviluppo larvale e la metamorfosi di C. intestinalis, fornendo nuovi elementi sui bersagli molecolari dell'NO in relazione allo sviluppo ed alla risposta allo stress. Una serie di esperimenti, volti ad esaminare l'andamento e la velocità di metamorfosi in diverse condizioni dei livelli di NO, hanno rivelato che l'NO prodotto nelle larve di ciona contribuisce alla fosforilazione della MAP chinasi ERK, un evento chiave e necessario affinché la metamorfosi avvenga. In particolare, diminuendo i livelli endogeni di NO, trattando le larve alla schiusa con un inibitore della NOS o un agente che lega l'NO, si ottiene un rallentamento della metamorfosi ed una concomitante riduzione della fosforilazione di ERK. Al contrario, un aumento di NO mediante l'uso di un donatore di NO, determina una accelerazione del processo accompagnata da un aumento di attivazione di ERK. Su questa base, é stato ipotizzato un possibile meccanismo per spiegare la fosforilazione di ERK indotta da NO, basato sulla nitrazione di ERK, come suggerito da esperimenti paralleli di immunoprecipitazione, che hanno mostrato la correlazione tra il livello di fosforilazione di ERK e la sua nitrazione. Un altro dato importante emerso da questa tesi è la dimostrazione che l'NO media anche una altra via di trasduzione durante la metamorfosi di ciona che comporta la nitrazione delle proteine. Il trattamento con l'agente nitrante, il perossinitrito, determina una accelerazione della metamorfosi, mentre agenti che legano l'NO provocano un effetto opposto. Un notevole aumento di nitrazione è stato rivelato allo stadio larvale rispetto a quello embrionale ed inoltre ERK e P-ERK sono risultate essere nitrate mediante metodologie immunochimiche. La scoperta di elevati livelli di proteine nitrate durante un processo fisiologico, quale lo sviluppo, riveste particolare importanza alla luce di dati sempre più numerosi in letteratura sulla nitrazione delle proteine quale una nuova via di trasduzione capace di agire direttamente o indirettamente su altre vie. Ulteriori esperimenti sono stati condotti per indagare la risposta allo stress in larve di ciona indotto dalla aldeide prodotta dalle diatomee, la decadienale (DD). Larve trattate con questa aldeide mostrano un ritardo della metamorfosi dipendente dalla concentrazione dell'aldeide e dallo stadio larvale al quale si fa l'incubazione. È interessante notare che il trattamento con DD determina una riduzione della fosforilazione di ERK analogamente a quanto osservato quando i livelli endogeni di NO vengono dimunuiti. Ulteriori studi saranno necessari per delineare il meccanismo con il quale DD influenzi la metamorfosi ed il coinvolgimento dell'NO.